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本制品是百奥莱博公司以探针法PCR技术为基础开发的，专门用于细菌和真菌进行研究检测的qPCR试剂盒。

细菌(Bacteria)和真菌(Fungus)是两类重要的微生物。细菌是单细胞生物，个体微小，结构简单，没有成形的细胞核，属于原核生物。细菌形态多样，有球状、杆状和螺旋状等。细菌广泛分布于自然界，在物质循环、生物共生等方面发挥着重要作用。但部分细菌能引起人类和动植物的多种疾病。真菌具有真正的细胞核，属于真核生物。真菌形态和大小差异较大，有单细胞的酵母菌，也有多细胞的霉菌和大型真菌。真菌在食品加工、酿造、医药生产等领域有重要应用，然而也有一些真菌会引发人类和动植物的感染性疾病。总之，细菌和真菌在生态系统和人类生活中既有有益的一面，也可能带来一定的危害。因此对细菌和真菌进行快速检测具有重要的意义。

1. 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
   
2. 引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/反应。
   
3. 提供阳性对照，便于排除假阴性结果。
   
4. 特异性高，引物是根据细菌和真菌DNA高度保守区设计，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。
   
5. 本制品只能用于定性分析，不推荐用于定量分析。
   
6. 细菌的探针用FAM标记，真菌的探针用Cy5标记。
   
7. 本制品只能用于科研。

细菌和真菌双重PCR引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入220μL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

1. 如果有N个样品，最好设置N+3个提取，多出的一个是细菌样品制备的PC(阳性对照)，一个是真菌样品制备的PC，一个是样品制备NC(阴性对照)。可以用10μL细菌PCR阳性对照(10⁴拷贝/μL)再加上一定量的水使总体积跟样本制备试剂盒所要求的起始样本体积一样，以此作为细菌样品制备PC；可以用10μL真菌PCR阳性对照(10⁴拷贝/μL)再加上一定量的水使总体积跟样本制备试剂盒所要求的起始样本体积一样，以此作为真菌样品制备PC。另外用水作为样品制备NC，水的总体积需要跟样本制备试剂盒所要求的样本体积一样。
   
2. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

3. 做定性分析只做1次重复，需标记N+3+3个PCR管，其中N+3个用于上步得到的N+3个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于细菌PCR阳性对照，1个用于真菌PCR阳性对照。
   
4. 按照下表在各PCR管中加入下列成分：
   

   成分	样品管 N+3个	PCR 阴性对照	细菌PCR 阳性对照	真菌PCR 阳性对照
   2×Probe qPCR MasterMix	各10μL	10μL	10μL	10μL
   细菌和真菌双重PCR引物-探针混合液	各4μL	4μL	4μL	4μL
   N+3个待测DNA样本	各6μL	不加	不加	不加
   超纯水	不加	6μL	6μL	6μL
   细菌PCR阳性对照(104拷贝/μL)	不加	不加	5μL	不加
   真菌PCR阳性对照(104拷贝/μL)	不加	不加	不加	5μL

5. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
   

   过程	温度	时间
   预变性	95℃	5min
   PCR反应 (45个循环)	95℃	15sec
   	60℃	30sec(采集FAM通道和Cy5通道的 荧光信号，淬灭基团均为TAMRA)

6. 如果扩增阳性对照或制备阳性对照结果为阴性，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要重做扩增或制备或跟厂家联系。如果扩增阴性对照或制备阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系，购买新的引物和探针。
   
7. 如果阴性对照和阳性对照正常，则实验有效，可以进入后续分析。
   
8. 对定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照的Ct必须大于40，或者没有Ct值。阳性对照的荧光信号必须有对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于40。对待测样品，如果其FAM通道的Ct大于40则为细菌阴性，如果小于或等于40则为细菌阳性。如果其Cy5通道的Ct大于40则为真菌阴性，如果小于或等于40则为真菌阳性。